Urodził się 20 marca 1542 roku w Skokówce. Pochodził ze średniozamożnej rodziny szlacheckiej z ziemi chełmskiej. W 1555–59 był paziem na dworze królewskim w Paryżu i pobierał nauki na Sorbonie. W latach 1561–64 studiował na uniwersytecie w Padwie, gdzie opublikował dzieło De senatu Romano libri duo i uzyskał doktorat obojga praw. Po powrocie do kraju, od 1565 był sekretarzem królewskim, od 1576 podkanclerzym koronnym, od 1578 kanclerzem wielkim koronnym i jednocześnie od 1581 hetmanem wielkim koronnym, a w latach 1581–85 także starostą krakowskim. W 1569–72 pracował w komisji porządkującej archiwum koronne. Politycznie związany z przywódcami ruchu egzekucyjnego, M. Siennickim i H. Ossolińskim. Poseł na sejm konwokacyjny 1573, przeforsował wówczas zasadę elekcji viritim, opowiedział się za wyborem Henryka Walezego i posłował po niego do Paryża. Po ucieczce Walezego przyczynił się do elekcji 1575 Stefana Batorego, był jego najbliższym doradcą, dążył wówczas do wzmocnienia władzy królewskiej, stając się głównym celem ataków opozycji. W latach 1580–81 odznaczył się w wojnie z Moskwą. Podczas bezkrólewia po śmierci Stefana Batorego poparł — zgłoszoną przez królową Annę Jagiellonkę i prymasa S. Karnkowskiego — kandydaturę Zygmunta Wazy. W 1588 pokonał pod Byczyną i uwięził jego konkurenta Maksymiliana Habsburga. Za rządów Zygmunta III Wazy pozostawał w opozycji, na wieść o tajnych układach króla z Habsburgami doprowadził na sejmie inkwizycyjnym 1592 do wyrzeczenia się przez króla planów ustąpienia im tronu. Groźba wojny z Turcją skłoniła Zamoyskiego do przedstawienia na sejmie w 1590 projektu opanowania Wołoszczyzny i przeniesienia linii obrony nad Dunaj; na drugim sejmie w roku 1590 doznał istotnej porażki politycznej, gdy sejm zniósł faktycznie dyktatorskie uprawnienia przyznane mu przez pierwszy sejm i zrehabilitował jego przeciwników. W roku 1595 i 1600 zbrojnie interweniował w Mołdawii i na Wołoszczyźnie, przeciwstawiając się próbie zjednoczenia przez Michała Walecznego księstw: wołoskiego i mołdawskiego, osadzając przejściowo jako lennika polskiego na Wołoszczyźnie Szymona Mohyłę, a w Mołdawii Jeremiego Mohyłę. W latach 1601–02 prowadził kampanię przeciw Szwecji w Inflantach, rezygnując z dowództwa po zdobyciu Białego Kamienia. Widząc w dążeniach królewskich chęć wzmocnienia władzy, uważając to za niebezpieczeństwo absolutyzmu, 1605 stanął na czele opozycji, która po jego śmierci rozwinęła się w rokosz sandomierski. Zamoyski był mecenasem literatury i dobrym mówcą. Doskonały gospodarz, zgromadzonym przez siebie majątkom (jego posiadłości wynosiły 6445 km2 i składały się z 11 miast i ponad 200 wsi, a dożywotnie królewszczyzny obejmowały 11 054 km2 i liczyły 12 miast i 612 wsi) nadał za zgodą sejmu status ordynacji z ośrodkiem dóbr w Zamościu (założonym przez siebie w 1580), który uczynił jednym z najpiękniejszych miast Rzeczypospolitej i gdzie utworzył Akademię Zamojską. Zmarł 3 czerwca 1605 roku w Zamościu.